Jeg vil begynne med en påminnelse som ofte går tapt i offentlige diskusjoner: Covid mRNA-vaksinene er genuint nye medisinske produkter.
Før nødgodkjenningene i 2020 hadde mRNA-vaksineteknologi aldri blitt tatt i bruk i stor skala på mennesker. Bare to kliniske studier, en fra Pfizer-BioNTech og en fra Moderna, hadde noen gang testet denne plattformen på mennesker. Totalt hadde omtrent 37 000 individer noen gang mottatt en mRNA-vaksine i medisinens historie (ikke inkludert tidligere erfaringer med rabies-, CMV- og kreftvaksiner begrenset til mye mindre tidligfasestudier). Det er ikke en kritikk; det er bare en konstatering av faktum. Men det betyr at den langsiktige sikkerhetsprofilen til disse produktene var, og fortsatt er, ufullstendig forstått.
Det som følger er kjent for nesten alle molekylærbiologer. Det er komplisert, men jeg prøver å forenkle det gitt innsatsen. Det er viktig å tydelig legge frem det molekylære rammeverket for alle, fordi hvordan disse vaksinene lages direkte avgjør hva som er inni ampullen.. Og det som er inni ampullen, når den er injisert, vil reise gjennom kroppen og aktivere en kaskade av hendelser som kan føre til langsiktige helsemessige konsekvenser.
In vitro-transkripsjon er ikke bare en produksjonsdetalj
Modifiserte mRNA-vaksiner produseres ved hjelp av en prosess som kalles in vitro-transkripsjon (IVT))IVT er metoden som brukes til å syntetisere det modifiserte mRNA-et som til slutt blir den aktive ingrediensen i vaksinen.
Dette er ikke en triviell teknisk detalj. IVT former fundamentalt den molekylære sammensetningen av sluttproduktet.
Forskere ved BioNTech, inkludert de som er direkte involvert i utviklingen av Pfizer-vaksinen, har publisert en detaljert gjennomgang1 som beskriver hvordan IVT-reaksjoner genererer ikke bare det tiltenkte mRNA i full lengde, men også en rekke biprodukter og urenheter, hvordan disse vanligvis fjernes, og hva deres biologiske konsekvenser kan være hvis de vedvarer. Disse produksjonsretningene sammen med biproduktene de skaper ble også beskrevet i detalj av Moderna i deres patenter (US10 653 712 B2 og US10 077 439 B2). Men enda viktigere, denne molekylærbiologien var veletablert lenge før Covid. Ingenting av dette er spekulativt.
Utgangsmaterialet: DNA-maler
I kjernen starter en IVT-reaksjon med dobbelttrådet DNA som koder for det ønskede proteinet. I dette tilfellet SARS-CoV-2-spikeproteinet.
Spike-kodingssekvensen som brukes i mRNA-vaksiner er genetisk modifisert for å forbedre stabilitet og cellulær toleranse, inkludert to aminosyresubstitusjoner som gjør den forskjellig fra viruspiggen. Denne modifikasjonen er tilsiktet.
Selve DNA-malen kan ha forskjellige former. Under Pfizers tidlige kliniske studier ble PCR-genererte DNA-fragmenter brukt. Den kommersielle produksjonsprosessen var imidlertid avhengig av DNA avledet fra plasmider. Dette er viktig fordi plasmider inneholder ytterligere regulatoriske sekvenser. I Pfizers tilfelle inkluderer disse elementer som SV40-promotor og ori-sekvenser, som gir grunn til bekymring hvis de skulle komme inn i menneskelige celler.
Når denne DNA-malen er lagt til IVT-reaksjonen, sammen med RNA-polymerase og andre komponenter, transkriberes den til mRNA (figur 1).
IVT produserer biprodukter etter design
Selv om det ønskede resultatet av IVT er det tiltenkte mRNA-produktet i full lengde, er det faktiske resultatet mer komplekst. Disse inkluderer forskjellige biprodukter i form av (1) forskjellige RNA-arter, inkludert dobbelttrådet RNA (dsRNA), (2) DNA festet til RNA (RNA-DNA-hybrider), og (3) det frie DNA-et fra den opprinnelige malen (figur 2).
Dannelsen av disse biproduktene er godt dokumentert og uunngåelig, og det er derfor nedstrøms rensing er helt avgjørende for sikkerheten.
Figur 2. Biprodukter og forurensninger fra IVT-produksjon. Bilde tilpasset fra 1.
Rensing har kjente begrensninger
Etter produksjon er det to rensetrinn som trengs for først å fjerne DNA-et og deretter fjerne RNA-biproduktene (figur 3):
Figur 3. Fjerning av IVT-biprodukter. Bilde tilpasset fra 2.
For å fjerne DNA-et tilsettes et enzym kalt DNase I i reaksjonsblandingen, som vanligvis brukes til å bryte ned forurensende DNA. Selv om DNase I er effektivt mot fritt mal-DNA, viser flere studier, inkludert arbeid utført av BioNTech-forskere selv, at DNase I er ineffektivt til å fjerne DNA festet til RNA (RNA-DNA-hybrider).
Denne begrensningen er ikke kontroversiell. Den er dokumentert i litteraturen.
Hva uavhengige analyser har vist
Denne konteksten er avgjørende for å tolke nyere uavhengige analyser av ferdige vaksineampuller.
Forskere3 og regulatorer4 har rapportert å ha påvist DNA-forurensninger i så godt som alle testede ampuller. Disse forurensningene inkluderte både dobbelttrådet DNA og RNA-DNA-hybrider som virket resistente mot DNase I-fordøyelse.
I noen prøver var spike-kodende DNA tilstede i nivåer mer enn 100 ganger høyere enn andre plasmidsekvenser.5, noe som tyder på ujevn eller ufullstendig fordøyelse. Sekvensering og kvantitative PCR-analyser oppdaget videre DNA-fragmenter med en gjennomsnittlig lengde på ~200 basepar, hvorav noen oversteg 4 kilobaser. I flere tilfeller ble det observert sekvenser som spenner over nesten hele plasmidet.
Samlet sett reiser disse funnene alvorlige spørsmål om konsistensen og fullstendigheten av rensing under storskala produksjon, og om de potensielle biologiske konsekvensene av gjenværende nukleinsyrer hos mennesker.
Hvorfor nukleinsyreforurensninger er biologisk viktige
RNA og DNA er potente aktivatorer av medfødte immunforsvarsveier. Dette er ikke spekulativt. Mønstergjenkjenningsreseptorer og cGAS-STING-signalveien reagerer kraftig på fremmede nukleinsyrer, noe som utløser betennelse, veksthemming og til og med celledød.
Disse mekanismene er nettopp grunnen til at genterapiprodukter er underlagt streng sikkerhetstilsyn.
Ironisk nok ble Covid mRNA-vaksinene utviklet med modifikasjoner spesifikt for å redusere denne kraftige medfødte immunaktiveringen. Men RNA-DNA-hybrider og DNA-fragmenter vil fortsatt fremkalle sterke immunresponser til tross for disse modifikasjonene.
Utholdenhet reiser nye spørsmål
Det finnes nå betydelig bevis som viser at spike-mRNA og -protein vedvarer i menneskelig vev i uker, måneder og til og med år etter vaksinasjon (tabell 1).
Vi vet ennå ikke om denne vedvarende prosessen gjenspeiler langvarig mRNA-stabilitet, fortsatt translasjon eller DNA-baserte mekanismer. Men gitt sannsynligheten for DNA-integrasjon og langlivet ikke-integrert plasmid-DNA i muskelceller,6 Det er ikke urimelig å anta at vedvarende Spike mRNA, protein og antistoffer mot Spike år etter vaksinasjon ikke er relatert til DNA-urenheter og biprodukter etter IVT.
Tabell 1. Topping av mRNA og proteinpersistens etter vaksinasjon hos mennesker
Kortsiktige og langsiktige sikkerhetsmessige implikasjoner
Samlet sett reiser disse dataene flere viktige sikkerhetshensyn.
For det første er det rapportert om akutte immunreaksjoner, inkludert cytokinstormer og anafylaksi, umiddelbart etter vaksinasjon. Slike sterke inflammatoriske responser bør ikke avfeies direkte som ikke relatert til urenheter, spesielt gitt det som er kjent om nukleinsyreindusert immunaktivering.
For det andre, og mer kritisk, er det langsiktige risikoer. Vedvarende spike-ekspresjon kan sannsynlig bidra til kroniske immunsyndromer. Enda mer bekymringsfullt er muligheten for DNA-integrasjon, som medfører risiko for insersjonell mutagenese eller genforstyrrelse. Dette betyr en risiko for kreft eller utviklingsdefekter avhengig av hvor og i hvilken alder DNA-et ble integrert.
Det er verdt å merke seg at FDA selv oppgir i informasjonsarkene sine at disse vaksinene ikke har blitt evaluert for karsinogenitet (kreftdannelse) eller gentoksisitet (DNA-skade), et punkt som ville være rutinemessig og forventet i tilsyn med genterapi, der langsiktig overvåking er standard.
Det regulatoriske gapet rundt DNA i mRNA-vaksiner
Siden det egentlig ikke lenger er noen tvil om at det finnes DNA-rester i mRNA-vaksiner, er spørsmålet om gjeldende retningslinjer og sikkerhetsgrenser er passende for mRNA-vaksiner. Vi har blitt forsikret om at DNA-biproduktene er innenfor grensene som er angitt i de regulatoriske retningslinjene. Så hva er FDAs veiledning rundt DNA-biprodukter og forurensninger?
Den mest siterte FDA-veiledningen om rest-DNA (≤10 ng per dose) ble utviklet for virusvaksiner produsert i levende celler som er fragmenterte og «nakne», med begrenset evne til å trenge inn i menneskelige celler. mRNA-vaksiner produseres imidlertid ikke i celler, deres rest-DNA er ikke avledet fra vertsceller, og viktigst av alt, DNA-et i mRNA-vaksinene er ikke nakent. Det er assosiert med LNP-leveringssystemer, som spesifikt gjør det veldig enkelt for DNA-et å komme inn i celler. FDAs veiledning fra 2010 er tydelig på at den ikke etablerer en relevant sikkerhetsterskel for DNA assosiert med LNP-baserte produkter.
Den andre ofte siterte veiledningen er fra WHO for rekombinante proteinterapeutika som omhandler gjenværende DNA i produkter som monoklonale antistoffer eller hormoner produsert i konstruerte celler. Her igjen stammer gjenværende DNA fra vertsceller eller ekspresjonsplasmider, er tilstede som spor av ikke-innkapslet DNA (nakent), og sluttproduktet er et renset protein, ikke en nukleinsyrebasert terapi (mRNA-vaksine). Så denne veiledningen gjelder ikke for mRNA-vaksiner.
Verken FDA- eller WHO-regulatoriske standarder som oftest siteres for gjenværende DNA var utviklet for mRNA-vaksiner, og adresserer ikke direkte dette sikkerhetsproblemet.
Hva WHO sa om mRNA-vaksiner – etter utplassering
I 2022 utstedte Verdens helseorganisasjon retningslinjer spesifikt om mRNA-vaksiner7Det er verdt å merke seg at dette dokumentet ble utgitt etter den globale utrullingen av disse produktene. Det står spesifikt at denne veiledningen var et svar på: «sikkerhets-, produksjons- og regulatoriske problemstillinger knyttet til denne nye teknologien.Dokumentet inneholder også flere viktige uttalelser:
"Fordi detaljert informasjon om metodene som brukes til produksjon ennå ikke er tilgjengelig, kontrollene ennå ikke er standardiserte for trygge og effektive mRNA-vaksiner, og visse detaljer forblir proprietære og dermed ikke offentlig tilgjengelige, er det ikke mulig å utvikle spesifikke internasjonale retningslinjer eller anbefalinger på dette tidspunktet."
Det står videre: «De detaljerte produksjons- og kontrollprosedyrene … bør diskuteres med og godkjennes av NRA [Nasjonal reguleringsmyndighet]] på individuelt grunnlag fra sak til sak."
WHO erkjenner at kontrollene for mRNA-vaksiner ennå ikke var standardiserte, og at det ikke var mulig å etablere spesifikke internasjonale retningslinjer eller anbefalinger. Videre kreves det regulatorisk tilsyn for at nasjonale myndigheter skal kunne vurdere hver enkelt sak.
Dette ble opplyst etter at mRNA-vaksinene var blitt utplassert.
Og i skrivende stund har FDA fortsatt ikke etablert standardiserte retningslinjer for mRNA-vaksiner og gitt noen bevis og sikkerhetsbaserte data som støtter eventuelle begrensninger for DNA i mRNA-vaksiner.
Til slutt er det verdt å gjenta: Selv om mRNA-teknologi ikke er ny, ble den før Covid regulert som genterapi, ikke som en tradisjonell vaksine. Sikkerhetsproblemene rundt DNA-biproduktene i Covid-vaksiner vil være de samme med alle mRNA-vaksiner, inkludert de for influensa, RSV eller til og med mRNA-vaksiner for kreft.
Dette er fordi mRNA-produkter er fundamentalt forskjellige. De må gå inn i cellene og instruere dem til å produsere et fremmed protein. Dette er ulikt andre konvensjonelle vaksiner som leverer proteinet direkte. Det finnes ingen klinisk presedens for denne plattformen, og det finnes ingen klinisk presedens for gjentatt dosering. Og absolutt ingen presedens på populasjonsnivå.
På dette stadiet, uten pandemi, med akkumulerende mekanistiske data og kliniske observasjoner, og spredningen av mRNA-vaksineprodukter som kommer på markedet, trenger vi åpenhet og direkte engasjement i seriøse sikkerhetsstudier fra regulatorer, spesielt FDA som etablerer kritiske retningslinjer for produksjon av disse produktene – spesielt når det gjelder DNA-biprodukter.
Ny teknologi krever ny gransking – ikke taushet, gaslighting eller sensur.
Referanser
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al. Mol Pharm. 4. april 2022;19(4):1047–1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – «Deteksjon av integrering av plasmid-DNA i vertsgenomisk DNA etter intramuskulær injeksjon og elektroporering» (Gene Therapy, 2004). Hos mus ble nakent plasmid-DNA injisert intramuskulært, etterfulgt av elektroporering for å forbedre opptaket. Ved å bruke en svært sensitiv PCR på renset genomisk DNA (med gelseparasjon for å fjerne ekstrakromosomale former) identifiserte forfatterne fire uavhengige integrasjonshendelser 4 uker etter injeksjon. Junction-sekvensering bekreftet tilfeldige integrasjonssteder (ingen foretrukne hotspots), i samsvar med ikke-homolog endekobling. Integrasjonsfrekvensen var lav, men målbar. Dette er en av de klareste demonstrasjonene av faktiske spontane integrasjonshendelser in vivo for nakent plasmid-DNA i muskel. Det er verdt å merke seg at denne studien brukte forbedret DNA-levering via elektroporering, som man kunne sammenligne med den forbedrede leveringen via LNP-er.
Martin et al. (1999) – «Plasmid DNA Malaria Vaccine: The Potential for Genomic Integration after Intramuscular Injection» (Human Gene Therapy). Denne tidligere studien testet plasmid-DNA IM hos mus og brukte Southern blot-hybridisering og PCR på genomisk DNA med høy molekylvekt for å undersøke integrasjonen. Selv om persistensen stort sett var ekstrakromosomal, rapporterte de bevis som tydet på sjelden integrasjon i noen prøver (men ikke så definitivt sekvensert som senere arbeider). Den satte en standard for lav risiko, men anerkjente potensialet for hendelser med svært lav frekvens, noe som påvirket påfølgende FDA-veiledning om DNA-vaksiner.
Ledwith et al. (2000) – «Plasmid-DNA-vaksiner: Undersøkelse av integrering i vertscellulært DNA etter intramuskulær injeksjon hos mus» (Intervirology). Nakent plasmid-DNA injisert intramuskulært hos mus viste, og selv om ingen påvisbar integrering ble observert, ble DNA fortsatt påvist i quadriceps-muskelen opptil 26 uker. DNA-et var ekstrakromosomalt.
7 WHOs ekspertkomité for biologisk standardisering, 74. rapport, vedlegg 3. Evaluering av kvaliteten, sikkerheten og effekten av messenger-RNA-vaksiner for forebygging av smittsomme sykdommer: regulatoriske hensyn https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser er en fremtredende professor ved Institutt for utviklings-, molekylær- og kjemisk biologi ved Tufts University School of Medicine og direktør for Tufts Convergence Laboratory ved Tufts. Dr. Kuperwasser er internasjonalt anerkjent for sin ekspertise innen brystkjertelbiologi og brystkreft, og forebygging. Hun er medlem av den rådgivende komiteen for immuniseringspraksis.
Vis alle innlegg
